Elisa試劑盒競爭法測抗原的原理與步驟

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進行競爭結(jié)合反應(yīng)。競爭法測抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be的檢測一般采用此法。

 

1.  以稀釋液將待檢標(biāo)本做適當(dāng)稀釋（預(yù)試中確定）加入包被有已知抗原的酶標(biāo)板中（50ul/孔），加封口膠帶于37℃作用30min。

2.  棄反應(yīng)液，以沖洗液連續(xù)洗板5次并于吸水紙上拍干。

3.  加入酶標(biāo)抗體（濃度在預(yù)試中確定）。加封口膠帶后于37℃作用30min。

4.  重復(fù)第2步。

5.  加底物（濃度在預(yù)試中確定），加封口膠帶后于室溫下避光作用5-60 min，其間不時觀察，顯色滿意后加終止液50ul/孔。

6.  于酶標(biāo)儀測定OD值，OPD用492nm測定，TMB用450nm測定。

 

1.  每次實驗均應(yīng)做陰性對照、陽性對照及空白對照（以PBS代替標(biāo)本），后者為本底值，在分析實驗結(jié)果時應(yīng)扣除本底值，陽性對照<陰性對照<空白對照實驗成立。

2.  一般認為小分子抗原宜用本法檢測，而大分子抗原則宜采用夾心法檢測，但具體宜采用哪種方法應(yīng)根據(jù)試驗決定，本發(fā)與夾心法相比在操作上減少一步。包被抗體與酶標(biāo)抗體如果分別采用單克隆抗體和多克隆抗體時，宜用單克隆抗體作為包被抗體，以多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體。

3.  血清標(biāo)本中抗原濃度一般較低，故一般用原倍標(biāo)本進行檢測，必要時可進行稀釋測定，但應(yīng)重新摸索酶標(biāo)抗原的濃度，以確保方法的靈敏性。

4.  以酶標(biāo)記抗原的方法同酶標(biāo)記抗體。

5.  其它注意事項同酶聯(lián)免疫間接法。