心得體會(huì):組織樣本的western blot，這十點(diǎn)需要注意

利用組織樣本來(lái)進(jìn)行Western blot，這是許多實(shí)驗(yàn)室常常開(kāi)展的工作。不過(guò)，若是想獲得重復(fù)可靠的印跡結(jié)果，也絕非易事。在此，Bio-Rad的專家貢獻(xiàn)了一些經(jīng)驗(yàn)，可以幫助您獲得清晰的圖像和可靠的數(shù)據(jù)。

使用干凈的工具來(lái)收集和處理組織樣本。為了去除可能影響蛋白穩(wěn)定性的污染物，用預(yù)冷的中性緩沖液簡(jiǎn)單洗滌。洗滌后，在液氮中快速冷凍組織，以便保留蛋白的結(jié)構(gòu)和特征，比如翻譯后修飾（PTM）。組織樣本可保存在冰上，立即勻漿處理。若保存在 –20°C，蛋白仍然有可能降解，因此組織樣本要放在–80°C長(zhǎng)期保存。

在選擇jia的裂解緩沖液時(shí)，應(yīng)考慮pH值、離子強(qiáng)度、去污劑和變性劑類型等因素。放射免疫沉淀分析緩沖液（RIPA）是廣泛使用的裂解液。同時(shí)，在選擇過(guò)程中也要考慮目標(biāo)蛋白的定位，例如，細(xì)胞質(zhì)蛋白建議選用Tris-HCl裂解液，而核蛋白則首xuan RIPA。在富集各個(gè)組分的低豐度蛋白時(shí)，可能需要對(duì)組織組分進(jìn)行預(yù)先分離。裂解液的用量取決于組織的大小/重量；緩沖液與組織的比例對(duì)確保有效裂解很關(guān)鍵。

與細(xì)胞相比，組織需要更劇烈的破碎方法，如勻漿技術(shù)。為了進(jìn)一步解離組織并剪切細(xì)胞DNA，可能需要對(duì)樣本進(jìn)行超聲處理。這一步要避免起泡，因?yàn)樗鼤?huì)降低回收率。同時(shí)，脂質(zhì)會(huì)影響western blot的質(zhì)量，要盡量去除。從植物組織中提取蛋白也頗具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗鼈兏缓鞍酌福€含有大量可能干擾蛋白提取的代謝物。您必須針對(duì)特定的植物組織來(lái)優(yōu)化提取過(guò)程。

細(xì)胞膜的破壞會(huì)釋放出可降解蛋白質(zhì)的酶。為了限制蛋白酶的活性，可以向緩沖液中加入尿素等強(qiáng)變性劑，不過(guò)這些條件可能會(huì)影響某些蛋白質(zhì)的完整性，因此，裂解液中通常含有蛋白酶抑制劑混合物。常用的蛋白酶抑制劑包括PMSF、抑肽酶、亮抑酶肽和胃蛋白酶抑制劑。

SUMO化蛋白的鑒定可能特別有難度，因?yàn)槿コ齋UMO的異肽酶存在，并且通常只有一小部分蛋白被SUMO化。為了保留SUMO化，建議在裂解液中加入異肽酶抑制劑。去泛素化酶（DUB）的存在也會(huì)去除泛素結(jié)合物。因此，必須向細(xì)胞裂解液中加入EDTA或EGTA，以及dian乙酰胺（IAA）或N-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM）。IAA和NEM的使用濃度通常為5-10 mM。不過(guò)，某些蛋白可能需要更高的濃度，比如IRAK1。

測(cè)定樣本濃度，可確保每塊凝膠的上樣量相同，并方便比較各個(gè)樣本之間的蛋白水平差異，比如處理和未處理樣本，或?qū)嶒?yàn)各個(gè)階段的樣本。您可以采用Bradford分析來(lái)進(jìn)行總蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化。不過(guò)，如果樣本中包含不可溶和可溶蛋白，則Bradford方法不可靠，再次強(qiáng)調(diào)了均質(zhì)化的重要性。

根據(jù)您的蛋白在細(xì)胞中處于哪個(gè)位置，可選擇jia的上樣對(duì)照。對(duì)于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白，常用的對(duì)照是看家蛋白β-肌動(dòng)蛋白或β-微管蛋白；對(duì)于核蛋白，通常使用組蛋白H1或組蛋白H3。不過(guò)，近年來(lái)許多研究表明常用的看家蛋白不適合蛋白的歸一化，強(qiáng)調(diào)生理和病理因素可能影響它們的表達(dá)水平。另一個(gè)問(wèn)題是看家蛋白往往超出了檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍。

蛋白質(zhì)可轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜的機(jī)械強(qiáng)度更高，特別適合膜的剝離和再次結(jié)合。PVDF膜是疏水性的，需要在甲醇中預(yù)浸泡。NC膜的信噪比高，不需要甲醇預(yù)處理。需要注意的是，NC膜不能與含有SDS的轉(zhuǎn)移緩沖液一起使用。在選擇轉(zhuǎn)印膜時(shí)，您可能還需要考慮其他參數(shù)，比如孔徑。

在對(duì)組織裂解物進(jìn)行western blot檢測(cè)時(shí)，內(nèi)源IgG的信號(hào)和非特異性二抗結(jié)合可能會(huì)掩蓋低豐度的蛋白或某種分子量的蛋白。~50 kD和~25 kD的蛋白尤其需要注意，它們可能被變性IgG的重鏈和輕鏈所掩蓋。對(duì)于胸腺或甲狀腺等組織，這個(gè)問(wèn)題尤為明顯，因?yàn)樗鼈兒写罅康膬?nèi)源IgG。

為了確保一抗的特異性，必須使用陽(yáng)性和陰性的組織對(duì)照。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，使用已知表達(dá)高水平目標(biāo)蛋白的組織。推薦的陰性對(duì)照包括僅使用二抗（省略一抗孵育步驟）以及已知不表達(dá)目標(biāo)蛋白的組織樣本。此外，疾病狀態(tài)下特定蛋白質(zhì)的表達(dá)也會(huì)出現(xiàn)差異。為了解釋這些差異，hao使用健康組織和疾病組織的樣本。