elisa實驗中的包被要注意哪些問題

通常我們在進行Elisa試劑盒的實驗的時候，需要注意一些問題，例如溫育、顯色、包被等。其中，包被是需特別注意的一個問題，直接關系到實驗的效果。那么在實驗的時候包被要注意哪些問題呢？

   首先我們要知道什么是包被。

   在ELISA試劑盒實驗時將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。

   大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。

   親和素生物素  即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。脂類物質(zhì)無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。

   優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳?？乖昧可伲瑑H為直接包被的1/10乃至于/100。

   其次包被主要用哪些。

   1、包被用抗原。

   天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。

   2、包被用抗體

   IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結發(fā)生在Fc段上，抗體結合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。

   腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。

   后包被需要哪些條件。

   pH9.6碳酸鹽緩沖液

   pH7.2的磷酸鹽緩沖液

   pH7-8的Tris-HCL緩沖液

   加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。