大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT的操作步驟

大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT背景:

大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT用于測(cè)定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)的含量。

實(shí)驗(yàn)原理：

試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)水平。用純化的人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)，再與HRP標(biāo)記的2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)濃度。

操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為2400nmol/L，1600nmol/L，800nmol/L，400nmol/L，200nmol/L。

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育：

用封板膜封板后置37℃溫育3 0分鐘。

4.配液：

將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

5.洗滌：

小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.加酶：

每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：

操作同3。

8.洗滌：

操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10.終止：

每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。

11.測(cè)定：

以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。