小鼠泛素蛋白(Ub)elisa試劑盒操作步驟

本試劑盒僅供研究使用。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中小鼠泛素蛋白(Ub)水平。用純化的小鼠泛素蛋白(Ub)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入泛素蛋白(Ub)，再與HRP標記的泛素蛋白(Ub)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成*終的。顏色的深淺和樣品中的泛素蛋白(Ub)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中小鼠泛素蛋白(Ub)濃度。

小鼠泛素蛋白(Ub)elisa試劑盒組成

130倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶

2酶標試劑6ml×1瓶8標準品（480ng/L）0.5ml×1瓶

3酶標包被板12孔×8條9標準品稀釋液1.5ml×1瓶

4樣品稀釋液6ml×1瓶10說明書1份

5顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張

6顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

小鼠泛素蛋白(Ub)elisa試劑盒操作步驟

1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

240ng/L5號標準品150µl的原倍標準品加入150µl標準品稀釋液

120ng/L4號標準品150µl的5號標準品加入150µl標準品稀釋液

60ng/L3號標準品150µl的4號標準品加入150µl標準品稀釋液

30ng/L2號標準品150µl的3號標準品加入150µl標準品稀釋液

15ng/L1號標準品150µl的2號標準品加入150µl標準品稀釋液

3.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40µl，然后再加待測樣品10µl（樣品*終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

4.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

5.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

6.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

7.加酶：每孔加入酶標試劑50µl，空白孔除外。

8.溫育：操作同3。

9.洗滌：操作同5。

10.顯色：每孔先加入顯色劑A50µl，再加入顯色劑B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

11.終止：每孔加終止液50µl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)）。

12.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個月