顯色和比色在ELISA試劑盒實驗的影響

    自從20世紀60-70年代問世以來，Elisa法得到*科研工作者的認可及推崇，在歐美及中國獲得很大的推廣，尤其是國內(nèi)生化領(lǐng)域的長足發(fā)展。ELISA試劑盒有著準確性高、靈敏度高、特異性強等很多的優(yōu)點，它在檢測抗體、抗原等方面有很好的應(yīng)用，深受廣大用戶朋友的喜愛。然而，在實驗過程中，也需要注意很多問題，特別是顯色、比色問題。

elisa知識要點顯色和比色分析 

顯色 

    顯色是ELISA中的zui后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷。

    OPD（鄰苯二胺）底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長反應(yīng)時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行，ELISA試劑盒顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙轉(zhuǎn)向棕。

    TMB（四甲基聯(lián)苯胺）受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2小時后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。

比色 

    比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。

    比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。

    比色結(jié)果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為“A492nm"或“OD492nm"。

酶標比色儀

    酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標儀。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復(fù)性、度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可到0.001，準確性為±1%，重復(fù)性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對于空氣的真實A值應(yīng)為1.083± 0.01(1.073～1.093)，重復(fù)測定數(shù)次，其A值均應(yīng)1.083±0.05（1.078～1.088）在之間。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在0.000～2.000，新型號的酶標儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A值常以“*"或“over"或其它符號表示。應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為0.000～2.900，而其線性范圍僅0.000～2.000，這在定量ELISA中制作標準曲線時應(yīng)予注意。

    酶標儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。

    測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。ELISA試劑盒有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1，630nm為W2，zui終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。