ELISA試劑盒方法與硝酸纖維素膜微粒介紹

1　實(shí)驗(yàn)方法

1.1　混合抗原直接測(cè)試　
按豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析文章講述的方法［1］，將1.2ml大鼠原血清加入7.0ml10％丙烯酰胺溶液，聚合后在10°C、200mA、2h條件下大鼠血清蛋白電泳吸附于NC膜，用蒸餾水漂洗后，切一10×100mm小條裝入10ml試管備用。對(duì)照組將同樣面積空白NC膜用蒸餾水漂洗后備用。ELISA試劑盒在上述裝有NC膜的試管中加入10ml DMSO，充分搖勻，室溫1h；加入等體積0．1mol／L　pH9．0碳酸氫鈉溶液，充分混勻。3000r／min離心3～5min，收集沉淀，即為含大鼠血清蛋白的NC膜微粒，用0．01mol／L　pH7.4　PBS-T洗滌離心3×5min；用含0.3％的1：50正常羊血清封閉、阻斷37°C30min或4°C冰箱；同上離心后用PBS將微粒體積調(diào)至5ml、用0.5ml離心管分裝，每管加入100μl微粒懸濁液；在各管中分別加入100μl倍比稀釋的HRP-羊抗鼠，37°C孵育30min；同上洗滌離心3次，加入100μl含0.1mol／L檸檬酸、0.2mol／L磷酸氫二鈉、雙氧水、鄰苯二胺底物溶液，于37°C暗環(huán)境反應(yīng)120min；每管加入1滴2mol／L硫酸終止反應(yīng)，同上離心，收集上清并加入96孔ELISA試劑盒酶聯(lián)板，用酶標(biāo)儀測(cè)試波長(zhǎng)490nm處OD值。重復(fù)測(cè)試3次。

1.2　電泳分離抗原測(cè)試　
首先免疫轉(zhuǎn)印鑒定抗原，ELISA試劑盒再根據(jù)免疫轉(zhuǎn)印結(jié)果進(jìn)行定位，將特定抗原帶裁下，測(cè)量NC膜面積，同上將NC膜微?；幚聿⑦M(jìn)行定量免疫測(cè)試。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用混合抗原直接測(cè)試和用電泳分離抗原進(jìn)行測(cè)試，抗體濃度與OD值間均有較好線性關(guān)系，當(dāng)抗體濃度為0.25～1．0ng／ml時(shí)線性，且陽(yáng)性組和陰性對(duì)照組OD值落在*范圍（見表1），即陰性對(duì)照組OD值為0.3左右，陽(yáng)性對(duì)照組為1.0左右。3次重復(fù)結(jié)果一致。
3　討論
用ELISA法進(jìn)行測(cè)試時(shí)，包被條件非常關(guān)鍵，對(duì)用于包被的抗原或抗體要求較高，其應(yīng)用范圍受限制。NC膜具有很強(qiáng)的吸附能力，從而出現(xiàn)了以該材料為基礎(chǔ)的斑點(diǎn)免疫檢測(cè)法［2～4］。其對(duì)被吸附的抗原要求不高，粗制抗原便可用于檢測(cè)，但吸附時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)，被吸附抗原如果含有表面活性劑便不能用于檢測(cè)。為了克服上述缺點(diǎn)，我們?cè)⒘艘环N電泳吸附斑點(diǎn)免疫法［1］，但該法需要將NC膜逐一截成小圓片放入酶聯(lián)板中，操作也不方便，定量不夠準(zhǔn)確。NCMPE法將電泳吸附抗原的NC膜變成微顆粒，分裝方便，能保證其均一性，定量準(zhǔn)確，由于在離心管中操作、洗滌等處理極為方便。免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)是抗原抗體檢測(cè)方面的重大突破，但應(yīng)用該方法難以將抗體定量。NCMPE法將免疫轉(zhuǎn)印識(shí)別的特定抗原帶處理成微顆粒，然后用ELISA試劑盒法定量測(cè)試抗體水平，充分發(fā)揮了免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)的高分辨率和ELISA定量法的高度性與高度靈敏性，可極為方便而準(zhǔn)確地將某種未知抗體定量。