酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定氯霉素CAP殘留

酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定氯霉素CAP殘留

（1）試劑和材料 以下所有試劑除特別注明外，均為分析純試劑；水為符合GB／T
6682規(guī)定的二級水。
①0．2mol／L硫酸
②卜葡糖苷酸酶
③乙酸乙酯
④異辛烷
⑤三氯甲烷酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定氯霉素CAP殘留
⑥乙酸鈉
⑦氯霉素檢測試劑盒（2—8~C冰箱中保存）
（2）儀器和設(shè)備
①酶聯(lián)免疫反應(yīng)讀數(shù)儀
②分析天平 精度0．00001g
③天平 精度0．01g
④冷凍離心機
⑤50ml具塞離心管
⑥勻漿機酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定氯霉素CAP殘留
⑦微型振蕩器
⑧回旋振蕩器
⑨微量移液器
⑩恒溫干燥箱
（3）測定步驟
①尿樣的制備 取上層用稀釋劑／洗滌緩沖劑稀釋5倍，備片
②肌肉組織（包括魚和蝦）中氯霉素的提取 取38組織，加入6mi的乙酸乙酯，勻漿lmin，在2000r／mln下，離心15min。取上層4mi，在70~C下蒸干。加入2mi的異辛烷：三氯甲烷（2：3）溶解剩余物，旋轉(zhuǎn)lmin。加Rmi稀釋劑／洗滌緩沖劑，再旋轉(zhuǎn)2rain。（如果有乳化現(xiàn)象，把試管放在80~C的恒溫室約20min，直至見到分離層）。再在2000r／min下離心10rain，取上層備用。
③肝／腎中氯霉素的提取 取3s組織，加入3ml乙酸鈉緩沖劑（o．1mol幾，pH 5）和8000U 9—葡糖苷酸酶，勻漿30s，置于37~C的恒溫箱內(nèi)2h。加12ml的乙酸乙酯，勻漿lmin，在2000r／Illin下，離心15min。取上層lml，在70~C下蒸干。加入2ml的異辛烷：三氯甲烷（2：3）溶解剩余物，旋轉(zhuǎn)lmin。加lml稀釋劑／洗滌緩沖劑，再旋轉(zhuǎn)2min（如果有乳化現(xiàn)象，把試管放在80~C的恒溫室約20min，直至見到分離層）。再在2000r／mln下離心10rain，取上層備用。
④測定。
室溫應(yīng)控制在19—25~C。
取在19～25 0C放置1—2h的試劑盒，按每個標準溶液和試樣溶液至少兩孔計算所需酶聯(lián)板條的數(shù)量，插入框架。每個微孔加入標準溶液或試樣溶液各25tzL，再在每個微孔內(nèi)加入酶標二抗100t~L，封口膜封板，室溫下孵育1h。
倒出孔內(nèi)液體，將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，使孔內(nèi)沒有殘余液體。加入250／uL稀釋的稀釋劑／洗滌緩沖劑到酶聯(lián)板的微孔內(nèi)，稍后倒出孔內(nèi)液體，再將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，如此重復(fù)操作洗板6次。
用多道移液器加入底物125tzI。到每個微IL內(nèi)，室溫避光孵育20min。
用多道移液器每孔加終止液o．2mol／L硫酸100ul。
在10min內(nèi)將酶聯(lián)板放于酶標儀內(nèi)，于450nm波長處測定吸光度值。
（4）計算 用數(shù)據(jù)分析軟件對結(jié)果進行分析，繪出標準曲線，并得出試料中氯霉素的含量。
（5）靈敏度和回收率 本方法的檢測限為：尿樣0，25P8／L，肌肉0．1P8／k8
1．5ug／kg。
本方法在lug／kg添加濃度水平上，回收率范圍為60％～120％。