實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied biosystems公司推出，它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用對熒光信號積累的實時檢測來監(jiān)測整個PCR進程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。定量PCR是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染、實時和準(zhǔn)確等特點，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。
 
1. 分子生物學(xué)研究
 
⑴ 基因表達(dá)研究：細(xì)胞因子是一種調(diào)節(jié)蛋白，它對免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，包括對淋巴細(xì)胞激活、增生、分化、存活和凋亡的調(diào)節(jié)。這些低分子蛋白由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞所分泌，其量的改變常常與一些疾病，如炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)等有密切的關(guān)系。由于所得到組織樣本常常因為太小而不能滿足在蛋白質(zhì)水平的檢測，另外，通常用的蛋白質(zhì)檢測方法的靈敏度也難以完成對極微量的蛋白產(chǎn)物的檢測，所以應(yīng)用PCR檢測細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平就顯得很有意義。實驗研究表明：定量結(jié)腸直腸癌淋巴結(jié)的癌抗原mRNA的表達(dá)量，可以作為診斷癌癥微轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)。

⑵ 單核苷酸多態(tài)性及突變分析：實時熒光定量PCR一個誘人的應(yīng)用前景是用于檢測基因突變和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兊臋z測基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交，兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標(biāo)記。如靶序列中無突變，探針雜交便會降低雜交體的穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態(tài)性進行分析。拉米夫定是有效治療慢性乙型肝炎的抗病毒藥物，但臨床應(yīng)用中不斷有病毒變異的報道，這些變異可能是治療失敗或病毒對治療無反應(yīng)的原因。實時熒光定量PCR可以監(jiān)測乙型肝炎患者服用拉米夫定后體內(nèi)是否產(chǎn)生耐藥突變病毒。

2. 醫(yī)學(xué)研究

1）產(chǎn)前診斷：到目前為止，人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。

2）病原體檢測：目前，采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點。

3） 藥物療效考核：對乙型肝炎病毒 （HBV）、丙型肝炎病毒 （HCV） 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。

4）腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測癌基因的表達(dá)量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。
 

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