凝膠色譜法

凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。目前已經(jīng)被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫(yī)學等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應用于科學實驗研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。

　　一、基本理論

　　（一）分子篩效益

　　一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時，各分子在柱內(nèi)同時進行著兩種不同的運動：垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內(nèi)，在向下移動的過程中，從一個凝膠內(nèi)擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子zui小的zui后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有zui大極限和zui小極限。分子直徑比凝膠zui大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠zui小孔直徑小的分子能進入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會有三種情況，一是分子很小，能進入分子篩全部的內(nèi)孔隙；二是分子很大，*不能進入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子的可進入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動距離較短，分子較小的移動距離較長。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小“排隊，凝膠表現(xiàn)分子篩效應。

　　二）色譜柱的重要參數(shù)

　?、胖w積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt表示。

　?、仆馑w積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。

　?、莾?nèi)水體積：因為凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。不包括固體支持物的體積（Vg）。

　　⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve表示。當使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。當樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當樣品很大時，洗脫體積計算可以從應用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。

　　二、凝膠的種類及性質(zhì)

　?。ㄒ唬┙宦?lián)葡聚糖凝膠

　?、臩ephadexG交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯數(shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。

　?、芐ephadexLH-20，是─SephadexG-25的羧丙基衍生物，能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。

　　（二）瓊脂糖凝膠：

　　商品名很多，常見的有，Sepharose（瑞典，pharmacia），Bio-Gel-A（美國Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學滅菌活處理。

　　（三）聚丙烯酰胺凝膠：是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-P（Bio-GelP），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號很多，從P-2至P-300共10種，P后面的數(shù)字再乘1000就相當于該凝膠的排阻限度。

　　（四）聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel，具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機械強度好，洗脫劑可用甲基亞砜。

　　三、實驗技術(shù)

　?。ㄒ唬游鲋鶎游鲋悄z層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。

　?。ǘ┠z的選擇根據(jù)所需凝膠體積，估計所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量為20，1克SephadexG─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實驗室分離蛋白質(zhì)采用100-200號篩目的的SephadexG-200效果好，脫鹽用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。

　?。ㄈ┠z的制備商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時，自然膨脹需24小時至數(shù)天，而用加熱法在幾小時內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細菌和排除膠內(nèi)的空氣。

　?。ㄋ模悠啡芤旱奶幚順悠啡芤喝缬谐恋響^濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過SephadexG-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4%，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4%（一般約0.5-2ml），進行分族分離時樣品液可為凝膠床的10%，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時，樣品可達凝膠床的20-30%。分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。

　?。ㄎ澹┓乐刮⑸锏奈廴窘宦?lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:

　?、暖B氨鈉（NaN3）在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水，在20℃時約為40%；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標記蛋白質(zhì)。

　?、瓶蓸吠猍Cl3C-C（OH）（CH3）2]在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果*，在強堿性溶液中或溫度高于60℃時易引起分解而失效。

　?、且一鷰€基水楊酸鈉在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0.01%。在微酸性溶液中zui為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。

　　⑷苯基汞代鹽在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01%。在微堿性溶液中抑效果*，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。